Общая численность и биомасса бактерий

 Важным показателем, характеризующим состояние микробных ценозов в обследуемых морских регионах, является общая численность микроорганизмов и бактериальная биомасса.

Содержание микроорганизмов в морской воде оценивают обычно по числу клеток в единице объема. Выбор того или иного метода для определение количества клеток зависит от морфологических особенностей изучаемых микроорганизмов, характера роста, свойств культуральной среды, а также целей исследований.

Количество клеток микроорганизмов в единице объема воды можно определить либо непосредственно, либо путем учета роста на питательных средах.

Метод прямого счета бактерий состоит в непосредственном наблюдении и количественном подсчете микробных клеток в воде (точнее на мембранные фильтрах с размером пор 0,15-0,50 мкм) и обладает тем преимуществом, что дает возможность более точно, чем культуральные методы, оценить общую численность микроорганизмов. При этом учитывается также та часть микрофлоры , которая не растет на стандартных питательных средах или растет крайне медленно.

Определение общей численности микроорганизмов методом прямого счета.

Существует несколько модификаций метода прямого счета. Наиболее широкое применение получил метод ультрафильтрации предложенный Разумовым. Метод состоит в том, что определенный объем исследуемой пробы воды фильтруется через мембранные фильтры с размером пор 0,15-0,25 мкм В ходе фильтрации выделенные из воды микроорганизмы, более или менее равномерно распределенные по поверхности мембранного фильтра, окрашиваются и подсчитываются под микроскопом (с применением окулярного сетчатого микрометра) в нескольких полях зрения на определенной площади препарата.

Для фильтрацию проб обычно используются мембранные фильтры отечественного (Дубна . Владипор) и зарубежного производства (Сорториус-Германия, Нуклеопор -США и др.аналоги). Необходимо отметить, что при определения общей численности бактерий не следует применять фильтры фирмы MILLIPOR (США) ввиду специфичности их волокнистой структуры, т.к. бактериальные клетки не оседают на поверхности фильтра, а “проваливаются” в его толщу, что делает невозможным их микроскопирование.

Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирования ведется одновременно по отдельным морфологическим группам, что дает возможность охарактеризовать как состав микробного сообщества, так и (после суммирования данных) общую численность микроорганизмов (кл/мл) в исследованной массе морских вод. Далее, на основе полученных результатов, вычислить общую биомассу микроорганизмов

 

Прямой счет бактерий с использованием флуоресцентной микроскопии

В основе метода лежит эффект различного свечения (флуоресценции) окрашенных флуорохромами живых бактериальных и мертвых клеток в микроскопируемых препаратах.

Подсчет микробных клеток этим способом желательно производить в свежевзятых пробах вод, но при необходимости , можно использовать приемы фиксации этих проб с последующим хранением (не более недели) в замороженном виде.

Для подсчета бактерий их обычно окрашивают акридином оранжевым и концентрируют центрифугирование или фильтрацией на фильтры.. В проходящем свете с длиной волны около 450 нм. живые бактерии светятся зеленым светом. Мертвые и детрит - кирпично-красным. Микроскопирование препаратов и фильтров проводят под люминесцентным микроскопом.

К недостатка метода следует отнести возможный эффект флюоресценции самих фильтров и иммерсионного масла., используемого при микроскопировании. Чтобы избежать этих недостатков, рекомендуется использовать современные методы эпифлуорисцентной микроскопии на окрашенных в черный цвет мембранных или ядерных фильтрах типа Нуклеопор (США). Метод дает хорошие результаты при работе с пробами из богатых мезотрофных и, особенно, эвтрофных морских вод .богатых крупными клетками бактерий или обогащенных детритом водах прибрежной зоны и эстуариев.

Однако, к главным недостаткам флуоресцентной микроскопии следует отнести низкое разрешение при подсчете свечения мелких бактериальных клеток размером менее 1 мкм. и, следовательно, пропуск большей части этих мелких клеток. Их подсчет при этой методике требует большого напряжения зрения и специальных затемненных условия микроскопирования. В этом случае следует предпочесть относительно рутинный метод подсчета клеток на окрашенных эритрозином мембранных фильтрах.

 

Определение бактериальной биомассы и ее объема.

В практике морской микробиологии при определении бактериальной биомассы используют методы прямого микроскопирования и ряд более современных методов, основанных на применении техники тонкой биохимии.

Основным эталонным методом до сих пор остается метод прямого микроскоприрования, поскольку результаты, полученные при использовании биохимических методов, ряде случаев трудно интерпритируются (метод определения по АТФ), в других случаях ( методы мурамовой кислоты или липополисахаридов) достаточно сложны по процедуре анализа и дорогостоящи, в отдельных случаях недостаточно чувствительны или неприменимы для исследуемых объектов.

Бактериальная биомасса рассчитывается через определение ее объема (мкм³/л) на основе данных общей численности бактерий и среднего объема бактериальной клетки установленных методом прямого микроскопированием.

Для определение объема одной клетки используются формулы объема геометрических форм, характерных для каждой группы бактерий ( например: шар -для кокков. и т.д.) и их средние линейные микроразмеры. Средние размеры можно установить как для живых клеток (с дальнейшим определением сырой биомассы), так и для высушенных на фильтре(с дальнейшим определение сухой биомассы).Для облегчения подсчетов результатов измерений сводят в вариационные ряды.

Массу бактерий определяется по рассчитанному объему с учетом удельного веса бактерий. Полученные результаты суммируют и после пересчета данные могут быть выражены как сырая (или сухая) биомасса, Для сравнения бактериальной биомассы с биомассой других планктонных организмов и с запасами органического вещества в морской среде, исследуемые показатели удобно выражать в мкг С/л или граммах углерода под квадратным метром площади водной поверхности (г С/м²).

К недостаткам метода следует отнести затруднения, возникающие при подсчете бактерий в пробах, обогащенных детритом и бактериальными агрегатами, что часто происходит в эвтрофных водах морских бассейнов. Следует также отметить, что при измерении размеров клеток под сканирующим электронным микроскопом объем клеток оказывается заниженным в 2-2.5 раз.

 

Определение времени удвоения общей численности бактерий и продукции бактериальной биомассы

          Определение количества бактерий методом прямого счета дает наиболее полное представление о численности микроорганизмов в данном биотопе моря лишь в данный момент времени и является результирующей величиной скорости их размножения и выедания простейшими и зоопланктоном. Показателем скорости размножения бактерий считается время их генерации или период удвоения числа клеток. Время удвоения общей численности бактерий и продукция бактериальной биомассы относятся к числу важнейших показателей интенсивности микробиологических процессов в морской среде. Скорость размножения бактерий позволяет судить не только о новообразовании органического вещества в море ,но также об интенсивности процессов самоочищения. Прямой метод определения времени удвоения численности бактерий и бактериальной продукции (БП) основан на прямом подсчете (под микроскопом) изменения числа бактерий за определенный период времени в двух параллельных изолированных пробах воды: нефильтрованной (размножение бактерий происходит одновременно с их выеданием зоопланктоном) и фильтрованной (удален зоопланктон), где происходит преимущественное размножение бактерий.

Способ определения быстроты размножения бактерий разработан преимущественно к чистым культурам микроорганизмов и в его основу положено предположение, что бактерии размножаются в геометрической прогрессии - по экспоненте, однако в естественных микробных сообществах разные виды бактерий размножаются с различной скоростью. В следствии этого для оценки результата используемого подхода следует употреблять термин “время удвоения общей численности бактерий”.

Наиболее ответственными методическими этап исследований являются: соблюдения режима стерильности, удаление зоопланктона из проб фильтрацией и экспозиция образцов (склянок) c целью максимального приближения условий инкубации к естественным условиям в районе (горизонте) исследований.

Для предварительной фильтрации проб воды от зоопланктона необходимо использовать мембранные фильтры с размером пор от 1.2 до 5 мкм отечественного или зарубежного производства, например: марки СЫНПОР, MILLIPOR и др. Соблюдение условий инкубации образцов “in situ” достигается обычно экспозиции проб на буковых станциях за борт судна непосредственно в районе (и на горизонте) исследований или в аквариумах с проточной забортной водой. Однако, в настоящее время следует рекомендовать более широкое внедрение в практику работ использование лабораторных термолюминостатных аквариумов. Эти установки позволяют автоматически поддерживать необходимые условия экспозиции проб близкие к “in situ” непосредственно в лабораторных условиях вне зависимости от ее местонахождения и времени суток. Время экспозиции образцов в эксперименте должно быть достаточным для достоверно улавливаемой разницы между исходной и конечной численностью бактерий в пробе. Исходя из практики работ для летнего периода на средних широтах можно рекомендовать следующие продолжительности экспозиции: для евтрофных морских вод - 1-6 ч.; для мезотрофных - 6-18 ч.; для олиготрофных - 24-48 ч. При низких температурах вод (весна, осень, зима) время экспозиции проб необходимо в несколько раз увеличивать.

Определение продукции бактериальной биомассы прямым методом промзводят расчетным методом исходя из экспериментальных данных по времени удвоения численности бактерий описанных выше по традиционным формулам.

Необходимым методическим положением перехода от расчета численности бактерий к их биомассе является условие равенства исходной численности бактерий в фильтрованных и нефильтрованных пробах, что достигается использование фильтрацией воды через предварительные мембранные фильтры с диаметром пор в пределах 1.2-5 мкм.